La secuenciación de las vacunas bivalentes de ARNm de Moderna y Pfizer revela cantidades de nanogramos a microgramos del vector de expresión dsDNA por dosis
Un reciente estudio implemento varios métodos para evaluar la composición de ácido nucleico de cuatro viales vencidos de las vacunas bivalentes de ARNm de Moderna y Pfizer. Se evaluaron dos viales de cada proveedor con secuenciación Illumina, qPCR, RT-qPCR, fluorometría Qubit™ 3 y electroforesis Agilent Tape Station™. Múltiples ensayos respaldan la contaminación del ADN que excede el requisito de 330 ng/mg de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) y los requisitos de 10 ng/dosis de la FDA. Estos datos pueden afectar la vigilancia del ARNm de la vacuna en la leche materna o el plasma, ya que los ensayos de RT-qPCR dirigidos al ARNm de la vacuna no pueden distinguir el ADN del ARN sin tratamientos con RNasa o DNasa nucleasa. Asimismo, los estudios que evalúen la actividad transcriptasa inversa de LINE-1 y el ARNm de la vacuna deberán tener en cuenta los altos niveles de contaminación del ADN en las vacunas. Todavía se está investigando la proporción exacta de ADN fragmentado lineal frente a ADN de plásmido circular intacto.
Para evaluar la composición de ácido nucleico de las vacunas, el ADN de la vacuna se secuenció en profundidad utilizando dos métodos diferentes. El primer método utilizó un método RNA-seq de New England Biolabs disponible comercialmente que favorecía la secuenciación del RNA pero aún presentaba una cobertura de más de 500X para los vectores de DNA no anticipados. Los ensamblajes de RNA-seq tenían tractos poli A truncados en comparación con las construcciones descritas por Nance et al . El segundo método eliminó el ARN con tratamiento con ARNasa A y secuenció solo el ADN utilizando un kit de biblioteca de fragmentos de Watchmaker Genomics. Los ensamblajes centrados en el ADN generaron ensamblajes de vectores con tractos poli A más intactos (Figura 3).
Estos ensamblajes se utilizaron para diseñar ensayos multiplex qPCR y RT-qPCR que se dirigen a la secuencia de punta presente tanto en el ARNm de la vacuna como en el vector de ADN, mientras que también se dirigen al origen de la secuencia de replicación presente solo en el vector de ADN. El ensamblaje del vial 1 de Pfizer contiene una inserción de 72 pb que no está presente en el ensamblaje del vial 2 de Pfizer. Este indel es conocido por su mejora del promotor SV40 y su señal de localización nuclear (Dean et al. 1999) (Moreau y col. 1981) .
Múltiples métodos destacan los altos niveles de contaminación de ADN en las vacunas monovalente y bivalente. Si bien Qubit™ 3 y Agilent Tape Station™ difieren en su cuantificación absoluta, ambos métodos demuestran que es mucho mayor que el límite de EMA de 330 ng de ADN/1 mg de ARN. qPCR y RT-qPCR confirman la proporción relativa de ARN a ADN. Debe observarse una compensación de 11-12 CT entre las señales Spike y Vector RT-qPCR para representar un límite de contaminación de 1:3030 (2^11,6 = 3100). En cambio, se observaron compensaciones de CT mucho más pequeñas (5-7 CT) al observar los datos de qPCR y RT-qPCR con estas vacunas. Cabe señalar que los métodos Qubit™ 3 y Agilent tiñen todo el ADN en solución, mientras que la qPCR mide solo las moléculas amplificables sin sitios de corte de ADNasa I entre los cebadores. Cuanto más separe los cebadores de qPCR, menos moléculas detectables de Qubit™ 3 y Agilent se amplificarán. Los cebadores utilizados en este estudio tienen una diferencia de 106 pb y 114 pb, por lo que cualquier molécula que se corte con ADNasa I por debajo de esta longitud se subestimará con los métodos de qPCR en relación con las mediciones más generales de dsDNA de Qubit™ 3 o Agilent Tape Station™.
Esto también implica que las curvas estándar de qPCR que utilizan estándares de ADN sintético intacto al 100 % se amplificarán de manera más eficiente y, por lo tanto, subestimarán la contaminación de ADN digerido total. Por ejemplo, las curvas estándar con plantillas sintéticas de 106-114 pb proporcionan CT por debajo de 20 en el rango de picogramos (no en el rango de nanogramos), lo que sugiere que grandes porciones de la biblioteca son más pequeñas que el tamaño mínimo amplificable. Los estándares puros tampoco contienen altas concentraciones de ARNm modificado con secuencia idéntica que podría servir como sumidero de cebadores competitivo o inhibidor de los métodos de qPCR.
Como alternativa, el Qubit™ 3 y Agilent Tape Station™ podrían estar inflando la cuantificación del ADN debido a la intercalación de la diafonía del colorante con el ARN de N1-metilpseudouridina. Por esta razón, los investigadores creen que la proporción que observaron cuando estas moléculas se interrogan más escrupulosamente con polimerasas específicas para cada tipo de plantilla en qPCR y RT-qPCR es una métrica más relevante. La métrica EMA también se establece como tal relación.
Esto también pone de relieve si estos límites de EMA tomaron en consideración la naturaleza de los contaminantes del ADN. Podría decirse que el ADN competente para la replicación debería tener un límite más estricto. El ADN con promotores de mamíferos o genes de resistencia a los antibióticos también puede ser más preocupante que el ADN genómico de E.coli de fondo aleatorio de una preparación de plásmido (Sheng-Fowler et al. 2009) . El ADN de fondo de E.coli se midió con qPCR y tenía CT superior a 35.
Ha habido un debate saludable sobre la capacidad de los SAR-CoV-2 para integrarse en el genoma humano (Zhang et al. 2021) . Este trabajo ha inspirado preguntas sobre la capacidad de las vacunas de ARNm para integrarse también en el genoma. Tal evento requeriría la transcripción inversa impulsada por LINE-1 del ARNm en ADN como se describe por Alden et al . (Alden et al. 2022) . La contaminación con dsDNA de la secuencia que codifica la proteína de pico no requeriría LINE-1 para la transcripción inversa y la presencia de una señal de localización nuclear SV40 en el vector de vacuna de Pfizer aumentaría aún más las probabilidades de integración. Este trabajo no presenta evidencia de integración del genoma, pero subraya que la actividad de LINE-1 no es necesaria dados los niveles de dsDNA en estas vacunas. También debe verificarse la localización nuclear de estos vectores.
Secuenciación previa de las vacunas monovalentes de Jeong et al. solo publicó la secuencia de consenso (Dae-Eun Jeong 2021) . Las lecturas sin procesar para este proyecto no están disponibles y deben examinarse para detectar la presencia de una secuencia de vectores.
Dado que estas vacunas superan los límites de la EMA (330 ng/mg de ADN/ARN) con los datos de Qubit™ 3 y Agilent y estos datos también superan el límite de la FDA (10 ng/dosis) con las curvas estándar de qPCR más conservadoras, deberíamos revisar el lipopolisacárido ( niveles de LPS). La contaminación de plásmidos de las preparaciones de E.coli a menudo se co-contaminan con LPS. La contaminación con endotoxinas puede provocar anafilaxia tras la inyección (Zheng et al. 2021) .
Fuente:
Sequencing of bivalent Moderna and Pfizer mRNA vaccines reveals nanogram to microgram quantities of expression vector dsDNA per dose
Kevin McKernan, Yvonne Helbert , Liam T. Kane, Stephen McLaughlin
Genómica Medicinal, 100 Cummings Center, Suite 406-L, Beverly Mass, 01915
Periodistas por la Verdad no realiza valoraciones sobre los estudios de terceros. Para consultar algunas versiones alternativas les recomendamos leer: Addressing misinformation about excessive DNA in the mRNA vaccines | Therapeutic Goods Administration (TGA)