Resumen
Antecedentes: Las reacciones de transcripción in vitro (IVT) utilizadas para generar ARN modificado con nucleósidos (modRNA) para las vacunas contra el SARS-CoV-2 dependen actualmente de una ARN polimerasa que transcribe a partir de una plantilla de ADN. La producción de modRNA utilizada en el ensayo clínico aleatorizado (ECA) original de Pfizer utilizó una plantilla de ADN generada por PCR (Proceso 1). Para generar miles de millones de dosis de vacuna, este ADN se clonó en un vector plasmídico bacteriano para su amplificación en Escherichia coli antes de la linealización (Proceso 2), lo que amplió el tamaño y la complejidad del ADN residual potencial e introdujo secuencias que no estaban presentes en la plantilla del Proceso 1. Parece que Moderna utilizó un proceso similar basado en plásmidos tanto para las vacunas de ensayo clínico como para su uso posterior. Recientemente, los estudios de secuenciación de ADN han revelado este ADN plasmídico en niveles significativos tanto en las vacunas de modRNA de Pfizer-BioNTech como de Moderna. Estos estudios examinaron un número limitado de lotes y aún quedan preguntas sobre la variación en el ADN residual observada a nivel internacional. Métodos: Utilizando secuencias de cebadores y sondas publicadas previamente, se realizó una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y fluorometría Qubit® en 27 viales de ARNm adicionales obtenidos en Canadá y extraídos de 12 lotes únicos (5 lotes de Moderna niño/adulto monovalente, 1 lote de Moderna adulto bivalente BA.4/5, 1 lote de Moderna niño/adulto bivalente BA.1, 1 lote de Moderna XBB.1.5 monovalente, 3 lotes de Pfizer adulto monovalente y 1 lote de Pfizer adulto bivalente BA.4/5). Se consultó la base de datos del Sistema de Notificación de Eventos Adversos a las Vacunas (VAERS) para conocer el número y la categorización de los eventos adversos (EA) informados para cada uno de los lotes analizados. Se examinó el contenido de un vial previamente estudiado de la vacuna Pfizer COVID-19 mediante secuenciación Oxford Nanopore para determinar la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN. Esta muestra también se utilizó para determinar si el ADN residual está empaquetado en las nanopartículas lipídicas (LNP) y, por lo tanto, es resistente a la DNasa I o si el ADN reside fuera de las LNP y es lábil a la DNasa I. Resultados: Los valores del ciclo de cuantificación (Cq) (dilución 1:10) para el origen de replicación del plásmido (ori) y las secuencias de pico variaron de 18,44 a 24,87 y de 18,03 a 23,83 para Pfizer, y de 22,52 a 24,53 y de 25,24 a 30,10 para Moderna, respectivamente. Estos valores corresponden a 0,28 – 4,27 ng/dosis y 0,22 – 2,43 ng/dosis (Pfizer), y 0,01 -0,34 ng/dosis y 0,25 – 0,78 ng/dosis (Moderna), para ori y spike respectivamente medidos por qPCR, y 1.896 – 3.720 ng/dosis y 3.270 – 5.100 ng/dosis medidos por fluorometría Qubit® para Pfizer y Moderna, respectivamente. El promotor-potenciador-ori de SV40 solo se detectó en viales de Pfizer con puntuaciones de Cq que oscilaron entre 16,64 y 22,59. En un análisis exploratorio, encontramos evidencia preliminar de una relación dosis-respuesta de la cantidad de ADN por dosis y la frecuencia de eventos adversos graves (EAG). Esta relación fue diferente para los productos de Pfizer y Moderna. El análisis de distribución de tamaño encontró longitudes medias y máximas de fragmentos de ADN de 214 pares de bases (pb) y 3,5 kb, respectivamente. El ADN plasmídico probablemente se encuentre dentro de las LNP y esté protegido de las nucleasas. Conclusión: Estos datos demuestran la presencia de miles de millones a cientos de miles de millones de moléculas de ADN por dosis en estas vacunas. Utilizando fluorometría, todas las vacunas superan las pautas de ADN residual establecidas por la FDA y la OMS de 10 ng/dosis en 188 – 509 veces. Sin embargo, el contenido de ADN residual de qPCR en todas las vacunas estuvo por debajo de estas pautas, lo que enfatiza la importancia de la claridad y la coherencia metodológicas al interpretar las pautas cuantitativas. La evidencia preliminar de un efecto dosis-respuesta del ADN residual medido con qPCR y SAE justifica la confirmación y una mayor investigación. Nuestros hallazgos amplían las preocupaciones existentes sobre la seguridad de las vacunas y ponen en tela de juicio la relevancia de las pautas concebidas antes de la introducción de la transfección eficiente utilizando LNP. Con varias limitaciones obvias, instamos a que nuestro trabajo se replique en condiciones forenses y a que se revisen las directrices para tener en cuenta la transfección de ADN altamente eficiente y la dosificación acumulativa.
Fuente:
DNA fragments detected in monovalent and bivalent Pfizer/BioNTech and Moderna modRNA COVID-19 vaccines from Ontario, Canada: Exploratory dose response relationship with serious adverse events.