Por Hiroshi Arakawa
El ARNm es el “modelo” de los genes. Las proteínas se sintetizan traduciendo el ARNm en aminoácidos, tres bases a la vez, según las reglas del código genético. Sin embargo, si el marco de lectura cambia debido a inserciones o eliminaciones en la secuencia de bases, se sintetizará una proteína con una secuencia de aminoácidos completamente diferente. Las mutaciones genéticas causadas por inserciones o eliminaciones que cambian el marco de lectura de los aminoácidos se denominan “mutaciones por desplazamiento del marco”. Una mutación por cambio de marco es, por así decirlo, un error en el modelo mismo.
En términos generales, cuando haces algo, no puedes hacerlo correctamente a menos que lo hagas de acuerdo con el plano. Se ha descubierto que en el ARNm pseudouridinado se producen con frecuencia errores en la traducción a aminoácidos. Esto se llama cambio de marco del ribosoma y es un fenómeno en el que el modelo en sí es correcto, pero puede interpretarse erróneamente. Y se puede decir que esto es un defecto fatal en las vacunas de ARNm de pseudouridina. Esta vez presentaremos un artículo publicado en Nature sobre este cambio de marco.
La N1-metilpseudouridilación del ARNm provoca un cambio de marco ribosómico +1
Mulroney y otros (2023) Naturaleza
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06800-3#auth-Thomas_E_-Mulroney-Aff1
La N1-metilpseudouridilación del ARNm provoca un cambio de marco ribosomal +1 La
transcripción in vitro (IVT) del ARNm se caracteriza por su uso como vacuna para el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Como tal, es un método que puede luchar contra las enfermedades humanas. El ARNm de IVT se transfecta en células diana, donde se traduce en una proteína recombinante, y la actividad biológica o inmunogenicidad de la proteína codificada ejerce el efecto terapéutico deseado. Los ribonucleótidos modificados se incorporan comúnmente en los ARNm de IVT terapéuticos para reducir su inmunogenicidad inherente, pero sus efectos sobre la fidelidad traduccional del ARNm no se han investigado a fondo. Descubrimos que la incorporación de N1-metilpseudouridina en el ARNm provoca un cambio de marco ribosomal +1 in vitro, y que la inmunidad mediada por células contra el producto de cambio de marco ribosomal +1 del ARNm de la vacuna BNT162b2 aumenta después de la vacunación en ratones y humanos. El cambio de marco ribosómico +1 observado es probablemente el resultado del estancamiento del ribosoma inducido por N1-metilpseudouridina durante la traducción del ARNm de IVT, y El cambio de marco se produce en la matriz resbaladiza del ribosoma. Sin embargo, se ha demostrado que la orientación sinónimo de secuencias tan resbaladizas proporciona una estrategia eficaz para reducir la producción de productos de cambio de marco. En conjunto, estos datos contribuyen a nuestra comprensión de cómo los ribonucleótidos modificados afectan la fidelidad de la traducción del ARNm y pueden provocar efectos adversos de la traducción errónea de las vacunas contra el SARS-CoV-2 basadas en ARNm en humanos. Aunque no se han informado resultados definitivos, estos datos destacan el potencial de efectos no deseados en futuras terapias basadas en ARNm y demostrar la necesidad de optimización de secuencia.
El ARNm de las vacunas contra el coronavirus de Pfizer y Moderna está modificado con N1-metilpseudouridina (1-metilΨ), y esta modificación de pseudouridina protégé al ARNm de ser atacado y eliminado por el sistema inmunológico.
La N1-metilpseudouridina es una modificación que no se encuentra en el ARNm humano natural. Sin embargo, se sabe poco sobre cómo las modificaciones químicas del ARN, incluida la N1-metilpseudouridina, afectan la traducción a proteínas.
Ahora, la luz del insecto luciérnaga se debe a la enzima luminiscente luciferasa. Esta luciferasa se utiliza ampliamente como herramienta de cuantificación en diversos experimentos en el campo de las ciencias biológicas. Por cierto, aunque existe una fuerte imagen de luciérnagas que emiten luz cuando son adultas, en realidad, la mayoría de tipos de luciérnagas también emiten luz cuando son huevos o larvas. La mayoría de las especies cuyos adultos emiten luz son nocturnas, y las especies nocturnas utilizan la luz emitida principalmente para comunicarse durante el comportamiento de apareamiento.
Mulroney y otros investigaron cómo las modificaciones químicas del ARN afectan el marco de lectura durante la traducción. El gen informador utilizado en este momento fue Fluc. Usando luciferasa, si el marco de lectura de la traducción cambia en un punto específico (en otras palabras, si hay un cambio de marco), el marco de lectura de la luciferasa se vuelve correcto y puede detectarse mediante luminiscencia.
Dibujé la figura 0 para explicar el cambio de marco de los ribosomas. Cuando se traduce WT Fluc (tipo salvaje), se convierte en una proteína luciferasa normal, que puede detectarse con luz. FLuc +1FS (tipo de cambio de marco) es un vector informador diseñado para detectar el cambio de marco ribosómico.
Esto es un poco confuso, pero dado que los vectores de desplazamiento de marco originalmente contienen mutaciones de desplazamiento de marco, el marco de lectura de la traducción se desplaza a mitad de camino. La secuencia de aminoácidos detrás de la mutación cambia por completo, por lo que incluso si se traduce tal cual, se convertirá en una proteína anormal y no emitirá luz. Si esta mutación de cambio de marco se omite debido a un error de traducción (cambio de marco de ribosoma), se traducirá la proteína luciferasa normal. En otras palabras, se trata de un diseño experimental en el que un error en el plano original se puede detectar con luz si se corrige con un segundo error al leer el plano.
Los autores primero tradujeron genes indicadores de tipo salvaje con diversas modificaciones químicas in vitro y cuantificaron los resultados mediante luminiscencia, que indica la actividad de la Luciferasa. Se analizaron los ARNm modificados químicamente de 5-metoxi U, 5-metil C, 1-metil Ψ, 5-metoxi U + 5-metil C y 1-metil Ψ + 5-metil C. La traducción del ARNm de Fluc de tipo salvaje se redujo ligeramente mediante la modificación de 1-metilΨ o 5-metilC sola. Luego, la traducción se redujo aún más cuando ambos ribonucleótidos se incorporaron en una transcripción (Figura 1b). La incorporación de 1-metilΨ en el ARNm de Fluc+1FS aumentó significativamente el cambio de marco del ribosoma+1. En realidad, la cantidad es aproximadamente el 8% del Fluc de tipo salvaje (Figura 1c). No se observaron cambios de marco con otros ARNm modificados químicamente (Figura 1c).
De esta manera, el ψ 1-metilo fue “malinterpretado” cuando se tradujo en proteína in vitro. ¿Qué pasa en las células? Los autores lo examinaron utilizando la línea celular humana HeLa y se regeneró la actividad de la luciferasa (Figura 1d).
El Western blot es un método para detectar proteínas específicas separadas por electroforesis con anticuerpos. Polypéptidos que han sido desplazados +1 por el marco de referencia.
Todos los análisis realizados hasta ahora se han realizado con reporteros de luciferasa. ¿Veremos un fenómeno similar con la vacuna contra el coronavirus? También es importante saber si el cambio de marco también ocurre en el cuerpo.una variada ad de productos proteicos no planificados y respuestas inmunes inesperadas (Figura 2a).
Los autores inocularon ratones con la vacuna contra el coronavirus de Pfizer y cuantificaron las respuestas de las células T a las proteínas de pico, los productos de cambio de Coronavirus de Pfizer (Figura 2b).
Esta respuesta inmune anormal no se observa en ratones no tratados ni en ratones tratados con la vacuna contra el coronavirus de AstraZeneca (Figura 2b). Incluso si se produce un cambio de marco, la secuencia de proteínas es diferente.
Este fue también el caso de los humanos. En otras palabras, la respuesta inmune Al producto de cambio de llama también se detecta en los receptores de la vacuna contra el coronavirus de Pfizer (Figura 2f).
Los autores también secuenciaron el ARNm y confirmaron que el cambio de marco no se debía a mutaciones de ARNm.
Normalmente, un cambio de marco es causado por un error en el propio plano de la secuencia del gen.
La N1-metilpseudouridina no es un material de ARNm natural y no es necesariamente un material fácil para los ribosomas.
Como puede ver, los cambios de marco analizados en este estudio son solo una parte del panorama.
Las vacunas contra el coronavirus de Pfizer y Moderna han alterado significativamente la secuencia de ARN del coronavirus para aumentar la eficiencia de la traducción. de ARNm pseudouridinado tienen el defecto fatal de “no poder leer el plano correctamente”. y Moderna producen proteínas “inesperadas” en el cuerpo. También debemos considerar la posibilidad de que parte de la intoxicación por la vacuna contra el coronavirus, cuyo mecanismo de acción se desconoce, pueda ser causada por estas proteínas anormales.
La N1-metilpseudouridina también se encuentra en vacunas humanas basadas en ARNm y en terapias en desarrollo.
Este artículo fue publicado originariamente por https://note.com/hiroshi_arakawa. Lea el original.